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            PCR實驗中一聽到就令人 犯愁的PCR異常曲線

            來源: 上海聯碩生物科技有限公司   2020-12-14   訪問量:1227評論(0)

            und-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">3)如果是單一的孔位出現尖峰,除了考慮儀器或者孔位問題外,還要考慮反應體系是否有氣泡所致。

            解決方案:按照原因分析進行一一核查,對癥處理。

            背景知識

            判斷擴增曲線是否良好的指標


            1.曲線拐點清楚,特別是低濃度樣本指數期明顯,擴增曲線整體平行性好,基線平而無上揚現象,低濃度樣本擴增曲線指數期明顯。

            2.曲線指數期斜率與擴增效率成正比,斜率越大擴增效率越高。

            3.標準的基線平直或略微下降,無明顯的上揚趨勢。

            4.各管的擴增曲線平行性好,表明各反應管的擴增效率相近。

            ,

            PCR實驗過程中,我們經常會遇到各種奇特的擴增曲線,如何正確解讀這些曲線并且做出恰當的解決方案是我們一線實驗者需要練就的基本功。今兒,將多年累積的功力編成“武功秘籍”奉上,助你PK掉那些令人犯暈的異常曲線。

            異常曲線1:PCR擴增抑制


            原因分析:H07存在擴增抑制

            解決方案:將樣本稀釋后進行擴增(抑制物的影響可通過稀釋樣本消除

            異常曲線2:自動基線設置問題

            原因分析:自動基線問題

            解決方案:手動設置基線。將Baseline End設置為“擴增信號出現的前一個循環”即,圖片展原始為26,將其設置為20,點擊OK即可恢復正常曲線。

            異常曲線3:熒光定量PCR實驗結果中無Ct值出現

            原因分析:

            1)PCR參數設置錯誤:在設計循環參數時沒有設置熒光信號采集;

            2)模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況;

            3)引物或者探針降解:可通過PAGE電泳檢測其完整性;

            4)電腦設置了自動休眠。

            解決方案:按照原因分析進行一一核查,對癥處理。

            異常曲線4:斜直線型擴增曲線

            PCR實驗首次檢測呈斜直線型擴增曲線,再次復檢后結果基本均為正常陰性。

            原因分析:

            分液不準確,檢查檢測后的反應管可發現管內的PCR反應液量明顯少于正常管;反應管氣密性差,反應過程中溶液蒸發引起探針濃度增加,導致曲線呈斜直線狀。

            解決方案:分液均勻,上機前檢查八連管液面是否在同一水平線上;八連管蓋蓋嚴,上機前檢查是否有縫隙。

            異常曲線5:擴增曲線末尾起跳


            PCR實驗結果中有曲線出現末尾起跳但是沒有完整擴增的現象。

            原因分析:

            1)陰參曲線末尾起跳,通常表示存在污染;

            2)復檢樣本,排除非特異性擴增的可能性;

            3)正常樣本也可存在曲線末尾起跳,表示樣本濃度低或者加樣量不準確。

            解決方案:排除是否存在污染;排除污染原因后復檢樣本,如果復檢后曲線為陰性直線則說明之前的末尾起跳為非特異性擴增,如果復檢后曲線仍與之前一致則說明末尾起跳表示該樣本中待檢病毒核酸的濃度偏低。

            異常曲線6:山域型曲線

            原因分析:嚴重的蒸發會呈現先上升后下降的曲線,輕微的蒸發會是一種緩慢的上升,這兩類異常的曲線可以看一下檢測后的反應管液面是否有下降的現象來證明。

            解決方案:上機檢測前檢查八連管管蓋,保證無縫隙后上機擴增。

            異常曲線7:擴增曲線有向上或者向下的尖峰

            原因分析:

            1)儀器不穩定導致的擴增曲線異常(也可能突然停電或者電壓不穩);

            2)如果尖峰向下,可能是鹵素燈老化所致發射光源不穩定(指鹵鎢燈光源的激發器)

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