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            干貨!復雜的miRNA啟動子最全獲取方法

            來源: 上海吉凱基因化學技術有限公司   2020-12-7   訪問量:1381評論(0)

            microRNA(miRNA)是生理和疾病中調控基因表達的關鍵因子,通過抑制mRNA翻譯或促進降解介導靶基因的翻譯抑制。miRNA翻譯抑制的功能在過去的很多年被廣泛研究,但miRNA自身的轉錄調控機制卻缺乏有效的研究,其難點是miRNA啟動子難以捕獲。

            miRNA啟動子難以捕獲???啟動子不就是緊挨著轉錄起始位點(TSS)嘛,為什么說啟動子難以捕獲呢?小編見證了太多的科研者獲取miRNA啟動子時,直接延伸上游2k,這樣對嗎?

            lncRNA、mRNA等分子獲取啟動子時,直接取TSS上游序列即為啟動子,但此操作不適用miRNA,這要從miRNA的形成機制說起:前體pri-miRNA在基因組上轉錄,在細胞核進行第一次剪切,形成第二個前體pre-miRNA(長約70~120nt),pre轉移至胞漿進行第二次剪切,形成成熟體Mature,也就是功能性的miRNA(長約20nt)。目前數據庫只收錄了pre以及Mature,而沒有pri,但實際pri 5’端的第一個堿基才是TSS,由于pri未知,這就讓miRNA啟動子的獲取變得困難,而直接取pre上游序列作為啟動子肯定是不對的。
            圖1. miRNA的形成機制

            由于初級前體pri不穩定,且每個miRNA的pri長度都不一樣,更有甚者,同個miRNA在不同細胞系的pri長度都不同(pri前體的長度為幾百至幾千bp,小部分pri-miRNA能超過10 kb),且受限于技術及成本,所以目前數據庫是未收錄pri完整序列。

            日本科學家通過保守性及TRANSFAC權重矩陣推定了79個人miRNA的啟動子(miPPR),得出miPPR位置與相應miRNA之間的中位距離估計為5.5 kb的結論2
            表1(展示部分結果)
            a,染色體位置;b,啟動子長度;c,啟動子與miRNA的距離

            表2. 含有超長前體的pri-miRNA1

            那要獲取miRNA的啟動子該如何操作呢?完全束手無策了嗎?別急,且看下文:

            一、RACE實驗獲得準確的

            pri-miRNA前體序列

            要想準確獲得miRNA啟動子,必須確定前體pri的序列,至少是5'端序列。因此,RACE實驗是不二的選擇。通過已知的pre設計引物,進行cDNA末端克隆,獲得5'末端序列,此為TSS位點,TSS上游即為啟動子序列。Science的一篇文獻,通過RACE技術,成功擴增了多個果蠅pri(mir-276a,mir-277和mir-8)的5'端和3'端,并且還鑒定出pri-miR-276a和pri-miR-277有兩個TSS3

            圖2.RACE鑒定的果蠅三個pri-miRNA及其TSS位點

            并且通過啟動子截斷構建熒光素酶報告系統,驗證了miR-276a的TSS2活性更高:
            圖3.啟動子截斷實驗:P3,TSS1的- 487至+ 791;P4,TSS2的-239至+ 49;P5,TSS下游序列,驗證此區域有無啟動子;Empty,空載

            二、基于miRNA位置、算法的分析


            雖然RACE是最嚴謹的做法,但不是每個科研工作者都有條件操作,那么可以根據miRNA位置,并結合一些預測類型的數據庫進行分析、判斷、驗證。miRNA在基因座上存在三種位置情況:基因間(intergenic)、內含子內(intronic)、宿主基因內(host gene),miRNA位置信息可在NCBI-GENE(點擊進入)主頁的“Genomic context”及“Genomic regions, transcripts, and products”圖中獲得。PROmiRNA基于DeepCAGE數據,預測了7244個miRNA TSS,并標注了與miRNA的距離,發現基因間的pir前體長度較為分散,而其余兩種pir前體長度大部分都較短4
            圖4.三種位置的miRNA與TSS距離的分布

            基因間(intergenic)、內含子內(intronic)、宿主基因內(host gene)三種位置的miRNA啟動子獲取方式如下:

            1. intronic-miRNA

            miRNA位于基因(一般指mRNA)內含子的情況比較復雜,miRNA可能有自己獨立的啟動子,也可能來源宿主基因的內含子剪切產生miRNA,也就是miRNA跟宿主基因共用啟動子。

            Fatih Ozsolak等人利用核小體定位和染色質特征鑒定了175個人類miRNA的近端啟動子,觀察到三分之一的內含子miRNA具有獨立于宿主的啟動子,獨立啟動子TSS到miRNA的距離最短,平均為4.2 kb±3.5 kb;而使用宿主基因啟動子的TSS距離miRNA距離要遠得多,中位57 kb。這些結果表明,遠離其宿主TSS的某些內含子miRNA可能已經進化為采用附近的獨立新穎TSS,以使pri-miRNA的轉錄更快,更有效5。

            圖5.內含子miRNA與宿主TSS距離及
            是否用宿主啟動子的占比

            根據mRNA-miRNA表達譜實驗,與依賴宿主基因的miRNA相比,具有獨立啟動子的miRNA與宿主基因表達的正相關性較低(紅色),而依賴宿主啟動子的miRNA與宿主基因表達相關性較高(灰色):
            圖6.內含子miRNA獨立/非獨立表達與宿主表達的相關性

            根據以上研究結果,對于定位于基因內含子的miRNA,可以先驗證宿主基因與miRNA表達水平是否相關,再結合miRNA距離宿主TSS的距離,判斷miRNA是否獨立轉錄。

            2. host gene-miRNA

            不同于mRNA的intronic-miRNA,一些miRNA直接由lncRNA的外顯子或者內含子生成,這類lncRNA在命名時,直接命名為對應miRNA的HG(host gene),如MIR155HG(MIR155 host gene,Gene ID: 114614)、MIR17HG(miR-17-92a-1 cluster host gene,Gene ID: 407975),這類在數據庫已經鑒定出lncRNA為miRNA宿主基因的,表明miRNA產生來源宿主,直接取宿主啟動子即可,是三種情況最簡單、最準確的。
            圖7.內含子中的miRNA

            喉鱗狀細胞癌的發生與MIR155HG相關,而進一步的實驗證明,是miR-155-5p的上調導致了細胞增殖,而不是lncRNA-MIR155HG,這表明,宿主lncRNA主要作用是產生miRNA,而非自身發揮功能6。

            圖8.C,宿主lncRNA上調導致細胞增殖增加;D,miRNA增加、抑制分別導致細胞增殖增加、減少

            3. intergenic-miRNA

            基因間的miRNA,由于不存在宿主,所以一定有自身啟動子。前面論述過該類型miRNA與TSS的距離跨度較大,對于尋找啟動子,難度偏大。

            圖9.位于基因間的mir-124-3

            目前預測miRNA啟動子的方法不外乎基于啟動子保守性、組蛋白H3K4me3和DHS標記、TATA盒預測等方法。小編推薦三個網站分析(當然也是用):

            1. 懂生信的可以借助PROmiRNA(基于CpG含量,保守性和TATA盒親和力的算法)分析;

            2. mirtrans 基于組蛋白修飾、啟動子預測等算法預測miRNA啟動子。使用網站時,直接輸入miRNA的名稱,預測TSS位置,如查詢has-mir-17,網站給出了不同細胞系的起始位點不一致,并預測了轉錄因子,十分實用(對于TSS位點大于10k的,請謹慎參考):
            圖10. mirtrans預測的miRNA與TSS的距離

            3. 基于大部分pri前體在10k以內,則取pre上游5~10kb進行啟動子分析,找出可能存在的啟動子位置,再進行驗證(點此)。小編輸入人源MIR-183上游5k,分析出三個預測的啟動子,其中距離pre 1400bp=(5000-3600)的位置啟動子可能性最高。
            圖11.cbs預測的啟動子位置

            而后,結合圖三進行啟動子截斷,構建不同長度的啟動子區段,通過雙熒光素酶驗證啟動子具體座落位置即可。

            以上就是小編結合多篇文獻總結的miRNA啟動子特征以及驗證方法?偨Y下,要研究miRNA的啟動子,盡量先查詢文獻,看看有沒有該啟動子的報道,如果沒有,有條件的做RACE實驗,沒條件的,結合miRNA位置,以及預測類的網站,多構建一些pre前體上游序列,并進行截斷驗證?傊,miRNA啟動子研究沒有捷徑,吉凱基因可為您分析、設計一站式助力,趕快來掃碼咨詢吧。!
            【參考文獻】




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